結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引起的結(jié)核病仍然是全球公共衛(wèi)生的威脅。其中，耐藥結(jié)核?。―rug-resistant tuberculosis, DR-TB），尤其是耐多藥結(jié)核?。∕ultidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB）仍是全球結(jié)核病治療和控制的重大挑戰(zhàn)。2022年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2021年全球新發(fā)結(jié)核病例1060萬(wàn)，其中約45萬(wàn)例是利福平耐藥結(jié)核?。≧ifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB），全球范圍內(nèi)DR-TB的治療成功率為60%。因而研發(fā)出療效確切、依從性更好的新型抗結(jié)核藥迫在眉睫。開發(fā)具有獨(dú)特作用機(jī)制、可與目前使用或處在開發(fā)后期的藥物協(xié)同作用的新型抗結(jié)核藥物是最有效的策略。

2022年11月23日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所孫義成研究團(tuán)隊(duì)、楊劍研究團(tuán)隊(duì)和金奇研究團(tuán)隊(duì)在Science Advances雜志在線發(fā)表了題為“Application of combined CRISPR screening for genetic and chemical-genetic interaction profiling in Mycobacterium tuberculosis”的研究論文。首次實(shí)現(xiàn)CRISPR敲除文庫(kù)在細(xì)菌中的構(gòu)建及應(yīng)用。利用CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建基因組文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，是目前應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究的重要工具之一。CRISPR文庫(kù)篩選主要包括敲除（Knockout）和抑制（CRISPRi)等文庫(kù)篩選。CRISPRi進(jìn)行高通量文庫(kù)篩選已在原核生物及真核生物中得到大規(guī)模運(yùn)用；而CRISPR敲除（CRISPR-KO）文庫(kù)篩選尚未在細(xì)菌等原核生物中得到應(yīng)用。

該研究利用前期構(gòu)建的基于CRISPR和非同源末端鏈接（Non-homologous End Joining）的分枝桿菌高效基因組編輯技術(shù)（Yan, et al., mBio, 2020），在結(jié)核分枝桿菌中構(gòu)建出全基因組CRISPR-KO文庫(kù)。利用該CRISPR-KO文庫(kù)結(jié)合CRISPRi文庫(kù)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)等生物信息學(xué)方法，研究人員分析了結(jié)核菌的必需基因，并與已知數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了比較。研究結(jié)果證實(shí)了CRISPR-KO文庫(kù)篩選的可靠性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CRISPR-KO和CRISPRi文庫(kù)篩選各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和不足，而將它們組合應(yīng)用將能得到更全面、可靠的篩選結(jié)果。隨后，研究人員將CRISPR 組合文庫(kù)用于抗結(jié)核新藥貝達(dá)喹啉(BDQ)的化學(xué)-遺傳相互作用（chemical-genetic interaction）的研究，發(fā)現(xiàn)了結(jié)核菌中幾十個(gè)影響貝達(dá)喹啉耐藥/敏感性的基因（圖1）。

圖1. CRISPR組合文庫(kù)在BDQ殺菌中的篩選結(jié)果

為驗(yàn)證所篩選基因的功能，研究人員通過(guò)突變株構(gòu)建等遺傳技術(shù)，驗(yàn)證了兩個(gè)篩選得到的基因topA、lprG影響B(tài)DQ殺菌能力；通過(guò)藥物協(xié)同殺菌實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的靶標(biāo)藥物AMSA、LB04-III確實(shí)與BDQ具有協(xié)同殺菌作用。最后，根據(jù)篩選和驗(yàn)證結(jié)果，研究人員揭示了結(jié)核菌相關(guān)基因影響B(tài)DQ殺菌功效的作用機(jī)制（圖2）。

該項(xiàng)研究首次報(bào)道了CRISPR-KO文庫(kù)在細(xì)菌中開展功能基因組學(xué)研究。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)CRISPR-KO文庫(kù)篩選具有靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而CRISPRi文庫(kù)的優(yōu)勢(shì)在于其能篩選必需基因。兩種文庫(kù)組合進(jìn)行篩選，可以得到更全面的研究結(jié)果。該研究構(gòu)建的結(jié)核菌CRISPR組合文庫(kù)，可以廣泛應(yīng)用于抗結(jié)核藥物化學(xué)-遺傳相互作用的篩選研究，使研究人員可以更加全面地了解結(jié)核分枝桿菌的基因功能及其與抗結(jié)核藥物的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而有助于新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。此外，這種CRISPR組合文庫(kù)篩選也可以應(yīng)用于其它細(xì)菌的功能基因組學(xué)及化學(xué)-遺傳相互作用研究。

圖2. 結(jié)核菌基因影響B(tài)DQ殺菌能力的作用機(jī)制

該研究得到了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（CIFMS2021-I2M-1-043）、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2020YFA0907202）、國(guó)家自然科學(xué)基金（82002179）等項(xiàng)目的資助。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所孫義成研究員，楊劍研究員和金奇教授為本文的共同通訊作者，孫義成課題組博士后閆玫漪、楊劍課題組助理研究員鄭丹丹以及孫義成課題組博士生李斯尚為本文的共同第一作者。