結(jié)核病（TB）是威脅人類健康的重要傳染病，嚴重威脅著人類的健康。世界衛(wèi)生組織(WHO) 估算，全球結(jié)核潛伏感染人群約17億，占全人群的1/4左右； 2019年報告顯示2018年全球有1000萬新發(fā)結(jié)核病病例，124萬結(jié)核病死亡病例。結(jié)核病為全球帶來嚴重威脅與沉重負擔(dān)，新藥和更有效疫苗的研發(fā)突破迫在眉睫。結(jié)核病新藥和疫苗的研發(fā)依賴于對其病原菌-結(jié)核分枝桿菌的生長發(fā)育、分化、毒力及耐藥等相關(guān)基因的分子機制的研究。而有效的遺傳操作方法是基因分子機制研究的基礎(chǔ)。然而，由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢（大約16-24小時復(fù)制一代），同時缺乏有效的重組酶，結(jié)核分枝桿菌的遺傳操作方法一直是其研究中的瓶頸，尤其是對單一功能基因的編輯等。雖然現(xiàn)已有許多基因操作工具成功應(yīng)用于分枝桿菌中，如自殺質(zhì)粒、條件復(fù)制轉(zhuǎn)運載體、分枝桿菌噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)、反向遺傳選擇標記及長片段線性DNA分子，但這些方法存在著費時、低效以及重組效率低等諸多缺點。

孫義成課題組在mBio雜志發(fā)表了題為“A CRISPR-assisted non-homologous end-joining strategy for efficient genome editing in Mycobacterium tuberculosis”的論文，研究報道了將CRISPR-Cas系統(tǒng)與非同源末端連接系統(tǒng)（Non-homologous end-joining，NHEJ）偶聯(lián)，通過一系列優(yōu)化實現(xiàn)了在不同種分枝桿菌中進行高效快速的基因編輯。CRISPR-Cas系統(tǒng)能在基因組上匹配位置進行切割形成DNA雙鏈斷裂（Double strand break, DSB），DSB主要通過非同源末端連接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組（Homologous recombination, HR）兩種途徑進行修復(fù)。與真核生物修復(fù)途徑相比，細菌主要通過HR途徑對BSB修復(fù)。分枝桿菌中存在有內(nèi)源NHEJ途徑，本文通過調(diào)控NHEJ與HR的平衡關(guān)系：1）高表達NHEJ元件增加NHEJ修復(fù)效率；2）抑制RecA介導(dǎo)的HR，進而增加NHEJ修復(fù)效率；3）通過誘導(dǎo)啟動表達使CRISPR-Cas介導(dǎo)的DSB發(fā)生在菌體生長的穩(wěn)定期這三方面最終實現(xiàn)了在分枝桿菌中進行快速高效地基因刪除。與此同時，該系統(tǒng)能夠在結(jié)核分枝桿菌中進行精確刪除以及同時引入多重基因突變，在進行連續(xù)敲除時能夠大大縮短實驗周期。此外，由于該系統(tǒng)高效地編輯效率以及簡化的編輯流程，僅通過一次轉(zhuǎn)化即獲得到10⁴以上的突變株，因而使得構(gòu)建突變子庫成為可能，為深入研究結(jié)核分枝桿菌基因的功能，進而了解結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)機制提供可靠的技術(shù)支持。該研究工作得到了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程等項目的資助。